AÑO 2, Nro. 1, pp. 44-57, 1996
RADICALES LIBRES EN BIOLOGIA Y MEDICINA: UNA BREVE REVISION
(Free Radicals in Biology and Medicine: a brief review)
Gregorio Tiskow Drost, Ph.D.
Unidad de
Investigación en Fisiología, Decanato de Medicina, apartado postal 400, y Unidad de
Investigación en Ciencias Funcionales "Dr. H. Moussatché", Decanato de
Ciencias Veterinarias,
Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", Barquisimeto, Estado Lara.
Venezuela.
RESUMEN
En el presente trabajo se realiza una revisión de los aspectos teóricos relacionados con el proceso de generación de radicales libres en las células de tejidos animales, y acerca de la influencia de la peroxidación lipídica en tales procesos. Se describen igualmente, los mecanismos enzimáticos y no enzimáticos con que cuentan los organismos para prevenir y defenderse del ataque de tales compuestos altamente reactivos con moléculas orgánicas. De igual manera, se listan una serie de patologías en donde hay considerables evidencias sugiriendo la acción de los radicales libres; adicionalmente, se presentan los recientes hallazgos acerca de la influencia de estos agentes nocivos en los estadíos de salud-enfermedad y sus posibles implicaciones.
Key Words: Radicales Libres, Peroxidación Lipídica, Stress Oxidativo, Oxidantes, Anti-oxidantes, Oxido Nítrico, Anión Superóxido, Radical Hidróxilo.
INTRODUCCION
¿Qué es un Radical Libre?
Un radical libre (R) constituye una molécula o fragmento molecular que contiene uno o más electrones (e-) no apareados en un orbital más externo.
Una molécula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia o por pérdida de e- y también por fisión de enlaces homolíticos. Al romperse un enlace covalente en forma simétrica, ambos fragmentos retienen un e- y por tanto, se convierten en radical libre. Este e- desapareado confiere al radical libre una cierta inestabilidad tanto energética como cinética, lo que los hace compuestos altamente reactivos.
Constituyen ejemplos de radicales libres, el atomo de hidrógeno (H), la molécula de triclorometilo (CCl3), el anión superoxido (O2-), el radical hidróxilo (OH), óxidos de nitrógeno, como el óxido nítrico (NO), radicales peróxilo (RO2 ), alcóxilo (RO), entre otros. Los radicales libres han sido detectados por métodos químicos como las técnicas espectroscópicas de la resonancia del Spin del electrón, o métodos más sofisticados como el atrapamiento del Spin del electrón (Spin Trapping) (14).
El estudio de los radicales libres se ha enfocado desde el punto de vista médico y biológico, ya que las interacciones de estos compuestos con moléculas orgánicas han sido implicadas en un gran número de estados patólogicos, los cuales pueden jugar un papel significativo en el daño tisular (3).
EL PAPEL DEL OXIGENO
La mayoría de los organismos vivientes necesitan de oxígeno para poder sobrevivir, en donde este elemento es utilizado por las células para oxidar compuestos orgánicos.
El oxígeno está envuelto en muchas reacciones radicales a causa de los siguientes hechos:
a) Esta en un estado bi-radical (teniendo 2 electrones desapareados).
b) Esta es un estado basal de triplete (los spines de estos dos e- solitarios son parálelos).
Dos aspectos fundamentales pueden deducirse a partir de estos dos hechos (32):
i) El O2 es especialmente reactivo con otros radicales (se puede considerar como un enlace abierto o la mitad de un enlace).
ii) El O2 ha de ser activado antes que pueda entrar a una reacción con una molécula normal.
El oxígeno molécular (O2) actua como elemento oxidante al aceptar hasta cuatro e- en su orbital más externo (reducción tetravalente) para dar lugar a dos moléculas de agua:
O2 + 4H+ + 4e- 2H2O (1)
El oxígeno puede sufrir también reducción univalente, divalente o trivalente (al aceptar uno, dos o tres electrones) dando lugar a la formación de especies activadas de oxígeno. Los productos respectivos son: el radical anión superoxido (O2-), el intermediario peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidróxilo (OH ):
O2 + e- O2- + 2H+ + e- H2O2 + e- 2OH + 2H+ + e- 2H2O (2)
Estas especies activas tienen la particularidad de reaccionar con relativa facilidad con sustratos endógenos celulares (8).
FORMACION DE RADICALES LIBRES DERIVADOS DEL OXIGENO
Radicales Hidróxilo: Es una de las especies conocidas más reactivas (OH). Tienen una vida media muy corta, del orden de 10-10 a 10-11 segundos) y la reacción de este radical con moléculas orgánicas producen otros radicales libres secundarios. Son agentes muy oxidantes. La acción de los radiaciones ionizantes tiene efectos muy perjudiciales, ya que puede causarla fisión de enlaces O-H en el agua, originando radicales OH :
H2O H. + OH. (3)
Estos radicales OH. generados son muy reactivos con las proteínas, carbohidratos, lípidos y moléculas de ácido desoxirribonucleíco (ADN) (14).
Oxido Nítrico: Muy pocas especies de radicales libres son poco perjudiciales, o más bien, útiles in vivo.El óxido nítrico (NO) es sintétizado a partir del aminoácido l-arginina por las células endoteliales vasculares, fagocitos, algunos tipos de neuronas, y otros tipos de células (23). Esta sustancia es un potente agente vasodilatador y probablemente un neurotransmisor.
En todo caso, el NO tiene una gran capacidad de reaccionar con el radical anión superoxido (O2-), sobre todo si está en exceso en los tejidos (23). El exceso de NO puede ser tóxico, al dañar por ejemplo, proteínas con centro sulfuro-hierro u otros elementos constituyentes de la membrana celular.
Anión Superóxido: El anión superóxido (O2 -) es el producto de la reducción univalente del Oxígeno molecular. Este proceso fue descrito ya en 1931 por Haber y Willstater (16). En 1934, Haber y Weiss descubrieron la reducción secuencial trivalente del O2 (en combinación con un catalizador en presencia de hierro) la cual da lugar a la producción de intermediarios oxigenados muy reactivos. En el año 1959 McCord y Fridovich (22) aislaron una enzima, la Superóxido Dismutasa (SOD) que cataliza la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir del anión superóxido. Ahora bien, una acumulación de H2O2 conducen a un incremento en la producción de radicales OH a través de la reacción de Haber-Weiss:
H2O2 + O2- OH + O2 + OH- (4)
Pero esta reacción es muy lenta, y no puede realizarse sin catálisis. Se supone que son los iones férricos los que desempeñan el papel de catalizador:
H2O2 + O2- + Fe+3 -quelato O2 + OH + OH- (5)
o bién, a través de la reacción de Fenton:
H2O2 + Fe+2 complejo intermedio Fe+3 + OH + OH- (6)
El O2 es producido por células fagocíticas y ayuda inactivar virus y bacterias. Es mucho menos reactivo que el radical hidróxilo, pero un número importante de blancos biológicos son sensibles a él.
A partir del Peróxido de Hidrógeno: El peróxido de hidrógeno (H2O2) es generado in vivo a partir de la reacción de dismutación, catalizada por la enzima SOD, o a partir de la reducción divalente del oxígeno molecular:
2O2 - + 2H+ + 2e- H2O2 + O2 (7)
Esto genera H2O2, una molécula no radical, que se asemeja al agua en su estructura molecular, y es muy difúsible dentro de la célula. Algunos papeles metabólicos se han asignado al H2O2, por ejemplo, H2O2 generado en la glándula tiroides es utilizado por una peroxidasa para iodinar hormonas tiroideas (6).
FUENTES DE RADICALES LIBRES
La generación de radicales libres es constante dentro de los seres vivos, y se asocia fundamentalmente al metabolismo celular del oxígeno y a las reacciones de óxido- reducción. Se han descrito numerosos mecanismos boquímicos celulares responsables de la producción de radicales libres, a saber (7):
· A partir de la cadena respiratoria mitocondrial, peroxisomas y microsomas celulares. Esta fuente llega a contribuir con menos del 5% de la producción de radicales superóxido (4,7,14). La respiración celular es la principal fuente de energía de las células aeróbicas (generación de ATP). Las mitocondrias y los sistemas transporte de e- son el sitio de mayor oxidación celular, donde se promueve la reducción tetravalente del oxígeno hasta agua (ver ecuación 2). Los radicales libres así generados a partir del O2 son productos fisiológicos, pero peligrosos en potencia de la respiración celular.
· Fagocitosis. Los neutrófilos en contacto con moléculas extrañas, fagocitables, invaginan su membrana celular, envolviendo al material a destruir (fagosoma) aislándolo del citoplasma. La estimulación de éstas y otras células fagocíticas se acompañan de un aumento en el consumo de O2 y activación de una enzima de la menbrana, como lo es la NADPH-oxidasa (nicotinamida adenina dinucléotido fosfato oxidasa) responsable de la producción del radical anión superóxido. Hay también producción de moléculas de H2O2 por dismutación del O2- (39):
2O2 + NADPH + enzima 2O2- + NADP+ + H+ (8)
También los neutrófilos poseen una enzima, la mieloperoxidasa que genera radicales ClO. al reaccionar con H2O2:
Cl- + H2O2 ClO + H2O (9)
Así, un gran número de fagocitos activados por cualquier medio, pero sin el propósito para el cual están destinados en un área localizada pueden provocar daño tisular. Por ejemplo, el líquido sinovial en las articulaciones muy inflamadas de pacientes con artritis reumatoidea, contiene gran número de neutrófilos activados; los radicales libres generados y otros productos derivados de estos neutrófilos sinoviales contribuyen a aumentar más el daño en el proceso inflamatorio (13).
· Autoxidación de catecolaminas: en ciertos procesos, como la isquemia cerebral, hay liberación regional de noradrenalina y de dopamina ß-hidróxilasa de las terminaciones nerviosas en la zona de isquemia. Las Catecolaminas son degradadas por la enzima Monoamino Oxidasa (MAO), y ello envuelve un psso oxidativo con producción de un exceso de e-. En el proceso de reperfusión tisular, posterior a la isquemia, el O2 puede actuar como agente receptor de e- y producir radicales OH y moléculas de H2O2 (19).
· Síntesis de Prostaglandinas: en el metabolismo del ácido araquidónico, este puede ser metabolizado por ciclo-oxigenasas, o por lipo-oxigenasas, originando diversas sustancias con propiedades vasoactivas como prostaglandinas, trombóxanos, prostacíclinas, leucótrienos (31). Durante la fase de transformación del ácido araquidónico en endoperóxidos cíclicos bajo la acción de la ciclo-oxigenasa se producirán radicales OH. Estos radicales OH pueden intervenir secundariamente en la cáscada del ácido araquidónico, inhibiendo la ciclo-oxigenasa y favoreciendo la vía de formación del trombóxano A2 que posee propiedades agregantes de las plaquetas.
· Oxidación de Hipoxantina y Xantina hasta ácido úrico, la cual es catalizada por la Xantina Oxidasa, durante la cual se acopla una reducción del O2 a O2- :
Xantina + H2O2 + 2O2 ácido úrico + 2O2- + 2H+ (10)
· Otras probables fuentes de radicales libres in vivo incluyen: la radiación ionizante ya descrita; productos de la detoxificación (reacción de drogas y toxinas) celular, fotosensibilizadores, contaminantes atmosféricos y productos de la combustión de materia orgánica (3).
SISTEMAS FISIOLOGICOS DE DEFENSA CONTRA LA PRODUCCION DE RADICALES LIBRES
En condiciones normales, las células cuentan con mecanismos de protección, enzimáticos y no enzimáticos, contra la producción de radicales libres.
Entre los mecanismos celulares de protección enzimáticos se cuentan:
a) La enzima Superóxido Dismutasa (SOD). La misma se encarga de la reacción de dismutación del radical anión superóxido intracelular. La enzima pertenece a la familia de las metaloenzimas, catalizando la conversión de O2- a H2O2 a través de la siguiente reacción:
O2- + O2- + 2e- + 2H+ H2O2 + O2 (11)
A la SOD se la ha encontrado en varias formas activas; una conteniendo manganeso, la cual se halla localizada en la matriz mitocondrial, y otra conteniendo cobre-zinc localizada en el citoplasma celular (22). A esta enzima se le ha encontrado presente en todos los organismos animales y vegetales que viven bajo condiciones aeróbicas.
b) Catalasa y Glutatión peróxidasa (GP) conforman el principal sistema enzimático intracelular de remoción de moléculas de peróxido de hidrógeno (22). La catalasa se localiza a nivel de Peroxisomas, y la glutatión peroxidasa a nivel citosólico y mitocondrial. El mayor riesgo de la presencia del H2O2 es la producción del radical OH que es muy reactivo e inestable. A bajas concentraciones de H2O2 , este es removido por la glutatión peroxidasa en presencia de glutatión reducido (GSH), el cual es oxidado hasta glutatión oxidado (GSSG):
2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O (12)
A altas concentraciones de H2O2 la catalasa se vuelve primordial en su remoción:
2H2O2 O2 + 2H2O (13)
La enzima Glutatión Peroxidasa es selenio-dependiente, ya que un residuo de selenio-cisteína, esencial para la actividad de la enzima, está presente en el sitio activo de la misma.
Simultáneamente a lo anterior, existe la enzima Glutatión Reductasa, una flavoproteína (Conteniendo Flavin Adenín Dinucleótido), regenera GSH a partir de GSSG, con el NADPH como la fuente reductora (5):
GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ (14)
Entre los mecanismos no enzimáticos encontramos:
a) El a -tocoferol o vitamina E, que se le ha descrito como antioxidante de la fase lipídica, ya que por ser liposoluble, se particiona con mucha facilidad hacia la membrana, y transforma especies muy reactivas como los radicales libres OH o peróxilos en formas menos reactivas. Actua donando H+ al radical, y así confinando el efecto del radical; en adición, se producirá una forma de radical estable de vitamina E (20):
a -TH + LOO a -T + LOOH (15)
La vitamina E se conoce como un elemento esencial en la dieta humana. Una deprivación seria conduce a daños neurológicos importantes (24).
b) El ácido ascórbico o vitamina C, antioxidante de fase acuosa, la cual se localiza en altas concentraciones en ciertos órganos, especialmente en el ojo (12). A este elemento se le han reconocido por mucho tiempo, propiedades antioxidantes, y protege contra daños oxidativos a aceites de origen vegetal, grasas animales, alimentos con contenido elevado de grasas, etc. (25).
Estas funciones de la vitamina C son derivadas mayormente de sus propiedades redox. El compuesto actua donando hidrogeniones al radical libre, transformándose el ácido ascórbico (AH2) en ácido dehidroascórbico (A), con la formación del radical ascórbilo (A-) como intermediario, molécula que actua como radical libre, pero que normalmente es mantenido a bajas concentraciones en el plasma.
c) La ceruloplasmina, proteína circulante portadora de cobre, que puede actuar como antioxidante extracelular (12).
d) Existen otros compuestos no enzimáticos que han sido denominados "removedores de radicales libres o scavengers", que tienen en común, la de ser fácilmente oxidables. Entre ellos figuran la cisteína, el manitol, la tiourea, alopurinol, oxipurinol, hidroxitolueno butilado, desferoxamina, dimetilsulfóxido, dimetiltiourea, entre otros (11,12,14,30).
EL STRESS OXIDATIVO
Un desbalance entre la producción de especies radicales libres y los sistemas de defensa antioxidantes (enzimáticos o no), conducirá a la producción incrementada de radicales libres favoreciendo la aparición del stress oxidativo (14).
El stress oxidativo puede resultar de:
a) Disminución sustancial de antioxidantes, debido a malnutrición (carencias vitamínicas tipo C, E, de riboflavina, etc.).
b) Excesiva producción de radicales libres, ya sea por exposición a elevadas concentraciones de oxígeno o sometimiento a un proceso de respiración hiperbárica, presencia de toxinas que son metabolizadas para originar radicales libres, o por excesiva activación de sistemas productores de estos compuestos en condiciones fisiológicas (14).
LOS RADICALES LIBRES Y EL PROCESO DE PEROXIDACION LIPIDICA
El daño celular que resulta de una producción excesiva de radicales libres de oxígeno (stress oxidativo) ha tratado de ser explicado como una consecuencia de una alteración a la membrana plasmática a través de la oxidación de los residuos de ácidos grasos de la bicapa lipídica (1,34), proceso que se ha convenido en denominar peroxidación lipídica.
Se considera que la peroxidación lipídica ocasiona cambios en la composición química, y deterioros en la organización ultraestructural de las membranas celulares (9,10), disminuyendo la fluídez de las mismas (10,26,29), alterando su permeabilidad e inactivando receptores y enzimas unidas a la membrana (3,7,8,12,21,35,36).
El proceso de peroxidación puede ser inducido en una variedad de sistemas in vivo e in vitro, a través de diversos procesos tales como: el metabolismo de agentes químicos reductores (37), o durante la alteración de la homeostasis celular normal como es el caso del daño producido por la isquemia-reperfusión tisular (26), o la ausencia de calcio extracelular (38).
El mecanismo intrínseco de la peroxidación lipídica puede describirse como sigue:
En la Fase de Iniciación, hay la remoción de un hidrógeno alílico desde un residuo de ácido graso poli-insaturado (LH) por alguna de las especies de radicales libres derivadas del oxígeno; el átomo de hidrógeno es un radical libre por sí mismo, y su remoción deja un electrón desapareado en el átomo de carbono atacado:
LH + R. L + RH (Fase de Iniciación)
El radical carbonilo resultante (L) sufre rearreglos moleculares originando un dieno conjugado, y en presencia de oxígeno molecular da lugar al radical peróxilo (LOO):
L. + O2 LOO
El radical peróxilo puede sustraer un átomo de hidrógeno de otra molécula vecina (LH), la cual puede ser otro ácido graso insaturado, formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo radical lipídico (L), entrando la peroxidación en una Fase de Propagación:
LOO + LH L + LOOH (Fase de Propagación)
El grado de propagación de la reacción dependerá de varios factores, entre ellos la relación lípido-proteína en la membrana (la oportunidad de reaccionar un radical libre con una proteína de membrana, se incrementa al aumentar el contenido de proteína), de la composición de ácidos grasos, de la concentración de oxígeno, de la presencia de antioxidantes que inhiban la propagación de la reacción, y de la presencia de metales de transición como el hierro o cobre.
El hidroperóxido lipídico puede en adelante degradarse a una variedad de productos. Además, en presencia de metales de transición, el hidroperóxido produce un radical alcóxilo (LO) y un radical hidróxilo (OH), los cuales causan la Fase de Ramificación de la reacción, involucrando un mayor número de moléculas de sustrato en la peroxidación:
LOOH LO + OH.
Cuando la concentración de moléculas de sustrato se hace pequeña, los radicales libres comienzan a reaccionar entre sí, en distintas combinaciones provocando la formación de productos excitados (P*). El paso de estos productos excitados a su estado estable (P) ocurre con la emisión de cuantos de luz visible (hu ). Estas reacciones reciben el nombre de reacciones de terminación, y con ellas concluye la reacción en cadena mediada por radicales libres (9,14,26):
L + L P* P + hu
LOO + L P* P + hu
LOO + LOO P* P + hu
Aunque, los residuos de ácidos de ácidos grasos de la membrana celular son afectados por los radicales libres derivados del oxígeno, el papel o la importancia de la peroxidación lipídica en los procesos que conducen a muerte celular permanece aún sin dilucidarse en su totalidad. Por esta razón, han sido propuestos otros compuestos celulares que pueden sufrir ataque por parte de los radicales libres que incluyen, los ácidos nucleícos y las glicoproteínas.
RADICALES LIBRES Y PATOLOGIAS HUMANAS Y ANIMALES
Es interesante y crucial mencionar que el interés actual por el estudio de la acción de los radicales libres, y de la peroxidación lipídica sobre las membranas biológicas y sobre distintas estructuras celulares, se debe a que ha sido demostrado que estos procesos juegan un papel prominente en diversas patologías, a saber: envejecimiento celular, toxicidad del oxígeno, acción tóxica de muchas drogas, enfermedades neurológicas como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, Esclerosis Lateral Amiotrófica, el síndrome de Down, en el cáncer, diabetes mellitus, ateroesclesosis, colitis ulcerativa, enfisema pulmonar, preeclampsia-eclampsia, catarata ocular, malaria, en casos de transplantes de órganos como riñón y corazón, artritis reumatoidea, síndrome de distress respiratorio del adulto, enfermedades autoinmunes, isquemia cerebral y cardíaca, y hasta en el mismo síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (3,8,14,15,35,36).
Es muy conveniente señalar aquí, que el incremento en la peroxidación lipídica puede ser la consecuencia de una patología dada, o puede ser la responsable de la aparición de dicha patología (14).
El stress oxidativo ocurre como se ha descrito en un amplio rango de patologías humanas y animales. El entendimiento del papel jugado por los radicales libres en diversas patologías aún esta en sus inicios, mayormente debido a la carencia de métodos precisos de diagnóstico y estudio aplicables en los seres humanos. La terapia antioxidante promete un enfoque terapéutico útil, sobre todo en patologías donde otros tratamientos son poco efectivos.
ASPECTOS FUTUROS
La hipótesis de los segundos mensajeros:
Si bien es cierto que los radicales libres producidos en cantidades excesivas tienen efectos nocivos, como lo es el caso del radical hidróxilo, no menos cierto es el papel que juegan el óxido nítrico o el radical anión superóxido en cantidades mínimas.
Hay crecientes evidencias que señalan que aparte de los fagocitos, hay otras células que producen aniones superóxido a muy bajas concentraciones (17,32,33). Se ha propuesto que esta producción de anión superóxido pudiera relacionarse a reacciones del óxido nítrico, el cual es otro radical estable que actua como mensajero in vivo (27). El blanco fisiológico del óxido nítrico es el grupo heme- de la guanilato ciclasa soluble (18), la cual regula, vía del GMPc una gran variedad de procesos intracelulares. El sólo hecho que estos radicales pudieran participar en eventos de señalización biológicos, abre nuevas e interesantes áreas de investigación futura.
De actualidad también resulta el hecho, de los estudios que se realizan sobre la acción de radicales libres originados a partir de contaminantes atmosféricos. El ozono (O3) presente en la atmósfera de las ciudades excesivamente contaminadas (caso de la Ciudad de México), reacciona con los ácidos grasos poli-insaturados de los fosfolípidos de las membranas, y libera numerosos compuestos tóxicos. En presencia de agua se origina peróxido de hidrógeno, responsable de la producción de radicales hidróxilo (2).
El ozono puede fijarse así sobre células fagocíticas de los pulmones, e inducir la producción de radicales libres. Más interesante aún es lo demostrado recientemente acerca de que ciertas moléculas, particularmente radicales nitrato (NO3), pueden ser producidos durante la noche en circunstancias favorecedoras como las existentes en las zonas costeras contaminadas y en las grandes capitales (28).
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